大腸桿菌通用PCR試劑盒(含致病性和非致病性)說明書
樣本處理及要求：
1.血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000g離心20分鐘，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。
4. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
試劑盒組成及試劑配制： 1. 酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96孔）。
2. 標準品（Standard）：2瓶（凍干品）。
3. 樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶
4. 生物素標記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。
5. 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。
6. 生物素標記抗體（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）
7. 辣根過氧化物酶標記親和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）
8. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
反應五要素： 參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則： ①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。 ②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。 ③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC*隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。 ⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。 ⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列*有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。 ⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。 引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以*引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。 操作流程: 1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。 2.設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL； 3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。 4.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。 5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。 6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。 7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。 樣本：血清 血漿 組織勻漿等液體樣本 標記物：血清 血漿 組織勻漿等 應用：僅用科研實驗檢測定量，定性檢 檢測方法：夾心法 技術要求：全程按說明書步驟檢測，操作規(guī)范，專業(yè)，儀器設備齊全。 規(guī)格：48t/96t 性狀：液體 運輸方式：快遞發(fā)貨 有效期：6個月品 特點：靈敏性高，---性，吸附均勻，吸附性好，回收利用率高，是一款可以讓您放心選購的產(chǎn)品。 使用范圍：此產(chǎn)品供科研實驗使用，不得用于---。 用途：用于測定人血清、血漿、組織及相關液體樣本中的含量或活性。 注：本公司提供試劑盒免費代測服務。需要其他檢測試劑盒請咨詢銷售人員。
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