RNA的提取方法總匯
點(diǎn)擊次數(shù)：299 更新時(shí)間：2024-05-13
獲得高質(zhì)量的RNA是進(jìn)行很多分子實(shí)驗(yàn)（RT-qPCR，二代測(cè)序轉(zhuǎn)錄組分析，芯片分析，數(shù)字PCR，northem分析及cDNA文庫(kù)構(gòu)建等）的第一步，往往也是最關(guān)鍵的一步，下面主要講解的是RNA的八種提取方法。
1、熱酚法
本法主要用于少量細(xì)胞樣品RNA提取，其產(chǎn)量不高，但簡(jiǎn)單易行。
2、快速提取法
本法主要用于培養(yǎng)細(xì)胞，通過0.5%SDS裂解細(xì)胞，酚抽提去除蛋白質(zhì)和DNA沉淀，快速純化RNA。
3、鹽酸胍-有機(jī)溶劑法
本法由MacDonald 1987年在Strohman報(bào)道的方法基礎(chǔ)上改進(jìn)而成的，適用于沒有超速離心及設(shè)備的情況下提取細(xì)胞總RNA。它利用鹽酸胍抑制RNA酶，勻漿裂解細(xì)胞，有機(jī)溶劑抽提去除蛋白質(zhì)，通過選擇性沉淀RNA分子而去除DNA，提取的RNA質(zhì)量較好，但整個(gè)操作過程繁雜費(fèi)時(shí)。
4、氯化鋰-尿素法
本法首先由Auffray報(bào)道，利用高濃度尿素變性蛋白質(zhì)同時(shí)抑制RNA酶，3mol/L LiCl選擇性沉淀RNA。其缺點(diǎn)是有時(shí)會(huì)存在DNA污染，LiCl沉淀RNA會(huì)丟失一些小分子量的RNA，如5S RNA等。優(yōu)點(diǎn)是快速簡(jiǎn)捷，尤其適用于大量樣品少量組織細(xì)胞的RNA提取，其質(zhì)量可以滿足Northern分析，Oligo(dT)提取mRNA，SI核酸酶或RNase保護(hù)實(shí)驗(yàn)等。本法每提取107個(gè)細(xì)胞能提取總RNA約10?g。
5、異硫氰酸胍氯化銫超速離心法
原理：使用蛋白質(zhì)變性劑異硫氰酸胍有效抑制RNA酶的活性，經(jīng)過起始密度為1.78g/ml的氯化銫介質(zhì)，進(jìn)行密度梯度超速離心，RNA沉淀于管底，而DNA與蛋白質(zhì)在上清中。使用這種方法，不但能得到高質(zhì)量的RNA，而且能同時(shí)分離出細(xì)胞染色體DNA. 本法對(duì)于冷凍時(shí)間長(zhǎng)、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核不易分離的組織標(biāo)本以及富含RNA酶的組織細(xì)胞(如胰腺)的RNA提取尤其適合。此法提取的RNA的質(zhì)量好和成功率高，已成為提取哺乳動(dòng)物細(xì)胞RNA的常規(guī)方法。其缺點(diǎn)是操作復(fù)雜、流程長(zhǎng)，一次提取的樣品數(shù)量有限。
6、細(xì)胞質(zhì)RNA提取法 本法主要適用于培養(yǎng)細(xì)胞，首先去除細(xì)胞核，然后用蛋白酶K消化蛋白質(zhì)，酚/抽提去除蛋白質(zhì)。操作簡(jiǎn)單，同時(shí)能進(jìn)行多個(gè)樣品操作，多數(shù)步驟在室溫下進(jìn)行，提取的RNA質(zhì)量較高，可滿足體外無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)、cDNA合成、引物延伸以及核酸酶SI保護(hù)實(shí)驗(yàn)。本法提取的RNA產(chǎn)量一般為30～500?g/107個(gè)細(xì)胞。
7、酚-氯化鋰法同時(shí)提取細(xì)胞RNA和DNA
本法是在Elion和Warner報(bào)道的方法基礎(chǔ)上，有Sandeep等人于1990年改進(jìn)而成。它通過酚和SDS裂解細(xì)胞，變性，解聚蛋白，抑制RNase，并用EDTA保護(hù)DNA，最后根據(jù)RNA和DNA在Li+中的不同沉淀速度，而分離DNA和RNA。整個(gè)過程在2小時(shí)內(nèi)完成。RNA可用于Northern分析，DNA可用于內(nèi)切酶消化以及Southern雜交實(shí)驗(yàn)。
8、一步快速熱酚抽提法
基于Shomczynki和Sacchi兩人于1987年報(bào)道的RNA快速提取法，美國(guó)Promega公司有機(jī)地將這些試劑組合成總RNA試劑盒，使操作更為簡(jiǎn)單方便，并突出體現(xiàn)以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1)將已異硫氰酸胍、b-巰基乙醇和去污劑N-十二烷基肌氨酸鈉聯(lián)合使用，抑制了RNA的降解，增強(qiáng)了對(duì)核蛋白復(fù)合物的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離進(jìn)入溶液，提高了RNA的提取產(chǎn)量；2)RNA選擇性地進(jìn)入無DNA和蛋白質(zhì)的水相，容易被異丙醇沉淀濃縮，對(duì)大量或少量組織的細(xì)胞RNA提取，均甚合適；3)可在3小時(shí)以內(nèi)處理大量樣品，省略了氯化銫密度梯度超速離心步驟及其它方法使用的長(zhǎng)時(shí)間選擇性乙醇沉淀或LiCl沉淀。LiCl沉淀不但會(huì)導(dǎo)致小RNA(<5.8S)的丟失，而且Li+鹽的殘留還會(huì)抑制DNA的合成反應(yīng)。
